生物钟紊乱有啥后果？
撰文| 生物节律紊乱疾病猴模型研究团队 中国科学院神经科学研究所
基因编辑的克隆猴
雄鸡报晓，蜘蛛半夜结网，向日葵在清晨开放……自然界所有生物的生命活动都存在节律现象，与地球24小时的自转周期保持同步对于生物维持健康的生理状态至关重要。经过长时间的研究，人们发现，其实生物的节律与基因密切相关，2017年的诺贝尔生理或医学奖就被奖励给了三位研究节律相关基因的科学家。
现代社会压力使人类的作息时间很难严格遵循于体内的生物钟。加班、轮班，频繁地跨越时区，熬夜玩手机等等，越来越多人都面临着生物钟紊乱的困扰，因此研究节律对于现代与未来的社会有着非同寻常的意义。
我们都知道经常熬夜，生活不规律的人经常会出现很多精神问题，诸如脾气暴躁、社交障碍等等，然而传统上基于小鼠等动物模型的研究很难如实反映这些症状。但由于之前上对非人灵长类的基因编辑非常困难，因此对节律在这方面的研究也长期进展缓慢。
为此，中国科学院神经科学研究所的生物节律与衰老疾病研究组和非人灵长类研究平台经过两年努力，利用CRISPR/Cas9方法，成功构建了世界首例核心节律基因BMAL1敲除猕猴模型，仔细验证后发现了敲除猴模型存在昼夜节律紊乱，并表现出类似精神分裂症的症状。
昼夜节律（生物钟）调节人体诸多行为
哺乳动物的生物钟包括中枢生物钟和外周生物钟。大脑的生物钟不仅调控着我们睡眠-觉醒周期，也调节着诸多行为。外周生物钟受到中枢生物钟调控，同时也受进食、温度等因素的影响。衰老、长期熬夜、时差、肥胖或癌症等原因可能会导致外周生物钟与中枢生物钟不同步。昼夜节律紊乱与代谢综合征、自身免疫、神经退行性疾病和癌症等疾病密切相关。
在哺乳动物的大脑中有一个控制生物节律的“起搏器”，它是位于下丘脑的视交叉上核。视交叉上核根据自然界光-暗周期调控生理和活动节律，并能通过激素和神经信号调节外周生物钟，损毁视交叉上核的动物昼夜节律会完全消失。这个“起搏器”则是通过一系列节律基因调控昼夜节律，这些核心节律基因之一便是BMAL1。
BMAL1蛋白会与另一个蛋白CLOCK形成异二聚体，并与其他节律相关基因结合，启动这些基因的表达。随着这些基因的表达产物逐渐增多，它们将进入细胞核中，反过来抑制异二聚体的作用。如此循环，使基因的转录水平呈现出24小时的振荡周期。就是利用类似这样原理的通路，我们的大脑才能有一个自发的24小时生物周期。
相对于小鼠的昼伏夜出和大脑结构，猕猴更适合作为节律研究模型
大多数节律研究都是以小鼠为模式动物，可以用来深入探究节律的分子机制，但在转化应用方面，小鼠作为与人类生物节律相反的夜行性动物显然不是特别合适。于是该研究团队想到了在进化上与人类相近的非人灵长类，猕猴除了具有昼行性这一特性，在脑结构和功能上与人类高度相似，可以用来研究脑疾病和高级认知功能。随着近年来神经所新开发的缩短猴生殖周期技术的不断优化，以及体细胞克隆猴的实现，弥补了猕猴繁殖周期长，单胎数量少的不足，可以构建出足够数目的具有统一遗传背景的动物模型。
BMAL1敲除猴表现出节律活动异常和睡眠紊乱
其实在2015年底，神经所科研团队就曾经利用CRISPR/Cas9方法，针对核心节律基因BMAL1进行基因编辑，并在2016年中旬顺利出生了5只基因编辑小猴。
那么这些猴子有没有表现出周期紊乱的症状呢？
为此等到半年后小猴断奶，研究人员就从多个方面开始观察敲除猴的生物节律。研究人员给猴子们佩戴了“小米手环”，可以随时监测到它们的昼夜活动情况，发现敲除猴不再按照24小时的周期活动，在夜间活动明显增多，这说明敲除猴可能出现了失眠的问题。于是研究人员通过手术，在猴子背部皮下埋入记录脑电和肌电的植入子，分析其睡眠周期发现敲除猴的快速眼动睡眠（REM，浅睡期）和慢波睡眠（NREM，熟睡期）明显减少。有趣的一点是，Bmal1敲除小鼠的睡眠相比正常对照则是增多的，这也进一步提示了非人灵长类在脑疾病研究上的优势所在。在另一方面，研究人员通过搜集连续两天多个时间点的血液样本，对那些受节律调节的神经内分泌激素水平进行测定，发现帮助进入睡眠的褪黑素在敲除猴中分泌较少。同时还进行了血液分析，发现敲除猴的大多数节律基因表达异常，还有很多与睡眠剥夺，抑郁症以及衰老等相关的基因上调。
节律紊乱猴的精神症状
当然，之所以如此大费周章构建基因敲除猴，研究者最期望在这些猴身上再现节律紊乱者的精神症状，这些才是非人灵长类较之小鼠等实验动物的真正优势。研究人员给猴子们做了一个经典的听觉刺激实验，在给出的一连串规律的声音中随机插入特殊的声音，记录猴子听到声音时的脑电，发现敲除猴大脑在识别和反应这些特殊事件的能力上不如正常猴，这与精神分裂患者的情况类似。此外，有很多研究表明律紊乱或睡眠障碍还是一些精神疾病，如双向情感障碍，抑郁症，自闭症谱系障碍的早期症状。但是之前我们很难认定一只小鼠有抑郁或是双向情感障碍之类的问题，而这在灵长类身上就很明显了。研究人员在血液检测中发现与压力应激相关的皮质醇在敲除猴的血液中一直处于高水平，这让他们联想到敲除猴在与人接触时极度紧张的反应。当有人靠近敲除猴时，它会双手抱住头部，蜷缩在角落里，不敢活动。如果将敲除猴放入一个新环境中，它也不能很快地适应，不敢像正常猴那样在环境中自由探索。
这只生物节律紊乱体细胞克隆猴有些焦躁不安
节律紊乱往往伴随着神经退行性疾病的发生，神经退行性疾病患者往往会遭受各种各样的睡眠问题，包括失眠、睡眠中断、日间过度嗜睡，与人交流出现障碍等等。但在之前，人们一直不太清楚这些究竟是睡眠紊乱的直接后果，还是长期失眠或服药的副作用。
中国科学家创建世界首例生物节律紊乱体细胞克隆猴模型
此次克隆猴和“中中”、“华华”有何区别
去年，世界首批克隆猴“中中”和“华华”的诞生标志着非人灵长类体细胞克隆时代的到来。
不过需要注意的是，克隆“中中”和“华华”所使用的细胞来自流产胎猴的组织。那这有什么问题呢？
最大的生物节律紊乱体细胞克隆猴，总是没有安全感地抱着头。（中科院神经所提供）
我们知道，克隆猴最大的意义之一在于我们可以由此批量制造基因编辑的猴子。而之前的“中中”和“华华”都是野生型的猴子，从疾病研究应用价值上来说，不如基因编辑的猴子那么大。
“中中”、“华华”与本次研究所用的克隆猴流程示意图。科学家会先去除猴卵细胞的细胞核，然后在其中放入另一只猴的体细胞核，等待两者充分融合后，最后将这个核移植过的卵移植到代孕母猴体内等待克隆猴出生。
“中中”、“华华”与本次研究所用的克隆猴流程示意图。科学家会先去除猴卵细胞的细胞核，然后在其中放入另一只猴的体细胞核，等待两者充分融合后，最后将这个核移植过的卵移植到代孕母猴体内等待克隆猴出生。
除此以外，克隆的成功率与作为核供体的细胞有很大的关系。细胞和人一样会在生长繁殖的过程中逐渐衰老，随着细胞不断分裂，其中会积累越来越多的DNA突变，细胞的质量也会逐渐下降。
而“中中”、“华华”所用到的胎猴体细胞，本身就来自尚未出生的小猴，十分“年轻”，自然活力强。实际制作基因编辑猴所用的细胞比这要“年老”很多，更何况基因编辑本身还会对细胞的DNA造成一些损伤，所以我们一直会担心，经过这么一番折腾后，克隆的成功率会跌到多少。要知道“中中”、“华华”的克隆成功率尚不足1%，而克隆猴成本高昂，如果由此制造基因编辑猴的成功率太低，很可能就会因为成本问题而让这项技术长期停留在纸面上，刘真表示。
因此我们非常需要真正利用体细胞核移植技术制造出基因编辑的猴子来实现这项技术。在工作开展之前，孙强等专家已经通过直接向猴受精卵中注射CRISPR/Cas9的方法获得了不太完美的BMAL1敲除猕猴，之所以说不完美，是由于部分基因敲除猴属于“嵌合体”，体内不同细胞的基因型有差异，因此在最严谨的定义上说还不算是理想的动物模型。
左图为之前获得的一只Bmal1基因敲除猴，它在本次实验中提供了核供体细胞。右图为从它体内提取、培养的核供体细胞。
这次实验制造出了5只基因敲除的克隆猴，从效率上说与当初制造“中中”和“华华”的克隆实验相当，这在很大程度上打消了人们在效率上的担忧。
本次研究得到的5只BMAL1敲除克隆猴
研究团队仔细检测了这些克隆猴的细胞核基因型和线粒体基因型。如果是真的克隆动物，其细胞核的基因型一定和提供细胞核的那些细胞完全一致，而线粒体由于存在于细胞质当中，不会随着核移植一起转移，因此一定和提供卵细胞的猴子完全一致。就目前而言，比对细胞核与线粒体基因就是验证克隆动物的金标准。果不其然，这五只小猴的细胞核基因型与核供体细胞完全一致，而线粒体基因型则与卵供体猴一模一样，同时它们的所有基因与生出它们的代孕妈妈则彻底无关，完全符合克隆动物的鉴定金标准。
有些顽皮的克隆猴
从本次的研究可以看到，猴子表现出怕人，避免与人对视等等精神问题，而这些症状是以前在小鼠身上很难探测到的。
可以说，本次研究意味着克隆基因编辑猴技术由此从理论层面迈向了实践层面，鉴于目前克隆技术是制造基因编辑猴的成本最低、耗时最少的手段，而作为全球目前唯一掌握克隆猴技术的神经所，有望在未来的神经科学研究中抢先一步。非人灵长类的节律紊乱模型有望给节律研究带来新的突破，我们在非人灵长类模型制备技术上的领先将转化为整体基础科研，尤其是神经科学研究走向世界前列的历史机遇。
该研究基于昼行性的非人灵长类动物模型，将生物节律与睡眠问题、精神疾病、免疫炎症反应、早衰等重大疾病联系起来，既可为开发这些疾病的治疗手段提供稳固可靠的理论基础，又可将其与临床相结合寻求对人类更精准有效的干预方法。
研究工作得到了中国科学院战略性先导科技专项（B类）“脑认知与类脑前沿研究”， 上海市市级科技重大专项“全脑神经联接图谱与克隆猴模型计划”，及上海市定向征集项目“脑神经联接图谱研究”的支持。
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